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SKD-200定氮仪的实验报告

时间:2016-6-17 点击:2746次
实验目的:验证沛欧SKD-200型凯氏对低蛋白量样品的检测准确度与精确度
实验设计人:沙金
实验执行人:沙金
实验时期2010-3-11
 
仪器与试剂
凯氏定氮仪(SKD-200,上海沛欧分析仪器有限公司)
精密分析天平(FA2004,上海精科天平厂)
通风橱
水槽
500mL三角瓶若干
25mL酸式滴定管
50mL量筒
1mL移液器与枪头
10mL离心管
药匙
称量纸
 
固体硫酸钾/硫酸铜催化剂=3:1(w/w)
样品1:0.5mg/mL BSA 2mL(containing 50% glycerol)
样品2:0.5 mg/mL 大豆浸提液 2mL (containing 50% glycerol)
样品3:标准硫酸铵 (1mg N/mL)
空白对照:saline (containing 50% glycerol)
浓硫酸(AR)
35% NaOH
2% H3BO3
混合指示剂:0.1%溴甲酚绿乙醇溶液:0.1%甲基的红乙醇溶液=5:1
0.1N NaOH
0.1N HCl
0.01037N 滴定用HCl
 
操作步骤
1.      消化:
将预先称量好的固体硫酸钾/硫酸铜催化剂粉末约6g(可适当加量)小心加入洗净干燥的消化管底部;分别将样品1、2和空白对照(约2mL)各两份用分析天平差减法直接倒入消化管底部,记录各组重量;用量筒小心称取浓硫酸16mL加入各消化管底部。将消化管放在管架上,放入,启动通风橱。设置消化温度时间曲线:170℃(根据样品碳化和沸腾的情况,可适当提高或降低预消化温度,并尽量避免样品碳化沸腾挂壁以提高检测准确度),30min——250℃,10min——370℃(为保证消化效果,可根据情况适当提高至400℃以上),120min。当消化管内出现稳定的恒沸白色酸雾并回流时,可盖上消化管盖以减少硫酸损失。当样品被消化为明亮的蓝绿色或绿色液体时,即可停止消化,待其冷却至室温后,取出蒸馏,关闭通风橱。
 
2.      蒸馏:
向凯氏定氮仪的三个储液桶中分别加入足量的35%NaOH、2%H3BO3和蒸馏水(根据处理样品量,至少1L),旋紧储液桶盖子。开机,打开循环水,不放入样品,预蒸馏2min。向样品管中小心加入20mL蒸馏水以稀释硫酸,待其变为明亮的蓝色溶液时,小心放入蒸馏架,卡紧卡槽时注意将消化样品管口卡紧以防止氨蒸气流失;向500mL接收三角瓶中加入少量(约0.6mL)混合指示剂,并设定加硼酸12s,加碱8s,蒸馏8—9min,保存设置后启动仪器。当氨蒸气随冷凝水流出时(注意氨蒸气管出口浸没于接收三角瓶的硼酸溶液中),接收瓶中的硼酸溶液会由玫红色变为蓝色,待蒸馏完毕,用蒸馏水将氨蒸气管出口的残液冲洗入接收瓶后取出待测。将样品管取出,小心倒入水槽,并及时清洗。放入下一个样品管和接收瓶,重复以上操作。蒸馏完毕后,关闭循环水。待蒸馏水冷却后放出。如短时间内不再使用定氮仪,应用蒸馏水替换酸液和碱液,重复加酸加碱过程以清洗酸碱管路,维护设备。
 
3.      滴定
用0.1N NaOH、0.1NHCl、蒸馏水分别润洗酸式滴定管各三次,最后用0.01037N滴定用标准HCl润洗两三次。加入0.01037N滴定用标准HCl,并小心放液至0刻度。开始滴定,左手控制滴定速度,右手不断摇动混匀三角瓶中溶液。(可预先对样品消耗盐酸量有一个大致的估计,即每毫升0.01N盐酸可滴定约0.14mg氮)临近滴定终点时溶液开始由蓝色变为蓝灰色,在最后一滴或半滴时微微呈现紫红色。视线与滴定管水平时读取并记录盐酸消耗量。用0.01037N滴定用标准HCl补满至0刻度后,可滴定下一个样品。
 
实验结果:
1.      各组样品取样量:

 
空白对照
BSA (0.5mg/mL)
大豆浸提液(约0.5mg/mL)
取样前(g)
9.823
9.191
9.702
第一次取样后(g)
7.391
6.639
7.016
第二次取样后(g)
4.359
4.506
4.316
2.432
2.552
2.686
第二次取样量(g)
3.032
2.133
2.700
第一次取样量(mg)
0.00
1.1285
1.1878
第二次取样量(mg)
0.00
0.9432
1.1940

注:甘油密度1.2613g/mL,生理盐水密度1.00 g/mL,则样品溶液密度1.1307g/mL
蛋白取样量(mg)= 取样量(g)/ 样品溶液密度 X 0.5 mg/mL
 
2.      各组样品消耗盐酸量:

 
空白对照
BSA (0.5mg/mL)
大豆浸提液(约0.5mg/mL)
第一次取样量(g)
2.432
2.552
2.686
第二次取样量(g)
3.032
2.133
2.700
第一次盐酸消耗量(mL)
0.40
2.04
2.36
第二次盐酸消耗量(mL)
0.45
1.64
2.44
第一次滴定氮量(mg)
0.058
0.296
0.343
第二次滴定氮量(mg)
0.065
0.238
0.354
平均氮含量(mg/mL)
0.026
0.129
0.146
平均蛋白含量(mg/mL)
0
0.577
0.724
检测准确度
 
高于真实值15.4%
高于真实值约44.7%
检测精确度(SD%)
±7.26%
±2.75%
±1.99%

注:每消耗1mL0.01N的盐酸相当于0.14mg氮;动物胶K=5.6(N=18.0%),大豆制品K=6.0(16.7%)。
 
讨论:
从检测结果看,当测量氮含量为0.18mg时,标准偏差控制在±3%以内,而空白对照的含氮量进一步下降为0.03mg时,标准偏差仍控制在±10%以内,实验结果重复性较为理想。但两组实验测量值均大于真值,分析原因:1)BSA组高15.4%,怀疑实验场所距动物房较近,造成结果偏高。2)大豆浸提液组高44.7%,怀疑不仅有1)的原因,而且浸提液中含有较高的非蛋白氮干扰,建议将浸提蛋白沉淀后再以凯氏定氮法测量。
 
另:以标准硫酸铵检测的蒸馏回收效果,实验结果表明:当氮含量为1mg时,以1500W蒸馏器蒸馏8min,平均氮回收率为96.9%;以1500W蒸馏器蒸馏9min,平均氮回收率可达100%,蒸馏回收效果理想。建议对于低蛋白含量样品测量而言,降低蒸馏器功率,并适当延长蒸馏时间可进一步改善回收率,从而使结果重复性更好
 
 
 
 
注:作者系上海我武生物公司研发部生化博士
 
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